ИССЛЕДОВАНИЕ ЭффЕКТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОфЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА НА ПРОЛИфЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ РАКОВЫХ И ИММОРТАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭффЕКТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОфЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА НА ПРОЛИфЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ РАКОВЫХ И ИММОРТАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК

1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
2РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству»
Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Фрунзе, 11

Введение

Впервые лактоферрин (ЛФ) был обнаружен в молоке коров. Позже ЛФ был найден в клетках матки, в миелоидных клетках (особенно в гранулоцитах) и клетках мозга [1]. Первоначально ЛФ рассматривался как железосвязывающий белок молока с бактериостатическими свойствами. железо участвует в различных метаболических процессах, и регуляция его концентрации чрезвычайно важна. В частности, аномально высокое содержание железа приводит к повышенной продукции свобод ных радикалов, повреждающих белки и ДНК [2]. Кроме того, избыток железа приводит к активации микробного роста [3].

Существу ют две формы белка ЛФ – железонасыщенная (холо-лактоферрин) и железоненасыщенная (апо-лактоферрин). ЛФ, обладая высоким сродством к железу, связывает избыток ионов этого металла, которые могут находиться в слизистой кишечника, и тем самым противо действовать микробным инфекциям, а также уменьшать повреждения клеток, вызываемые свободными радикалами [4–5].

Начальная экспрессия гена ЛФ в эмбриогенезе млекопитающих отмечается на стадии 2–4 клеток и продолжается до формирования бластоциста, а затем прекращается до созре вания плода, когда данный белок появляется в нейтрофилах крови и эпителиальных клет ках дыхательного и пищеварительного трак тов [6]. Во взрослом организме ген ЛФ экс прессируется в эпителиальных клетках желез внутренней секреции, а белок секретируется в биологические жидкости. Наиболее высока концентрация ЛФ в молозиве и молоке, но в меньших количествах он обнаруживается так же в слюне, слезной жидкости, кишечнике и репродуктивных тканях [7–8].

В опухолевых клетках ген ЛФ не экспрессируется [9–14]. Эти данные позволили вы сказать предположение о возможности противоопухолевой активности ЛФ. Блокировка экспрессии гена ЛФ в раковых клетках может быть связана с эпигенетическим механизмом, определяемым увеличенным метилировани ем цитозина в ГЦ-богатых районах генного промотора [15]. При подкожном введении мышам в дозе 1 мг человеческий ЛФ (в фор ме лишенного железа апо-лактоферрина или насыщенного железом холо-лактоферрина) ингибировал рост перевиваемых опухолей, индуцируемых v-ras-трансформированными фибробластами и метилхолантреном, а также обладал антиметастазной активностью [16]. Коровий ЛФ ингибировал карциногенез кишечника, легких и мочевого пузыря у крыс при пероральном введении на стадии пост инициации [17]. При этом одновременное введение с карциногенами вело к подавлению карциногенеза, возможно, посредством су прессии ферментов фазы I, таких как цитох ром P450 1A2 (CYP1A2), который индуцируется карциногенными гетероциклическими аминами. Кроме того, повышение глутатион S-трансферазы также могло играть роль в пост-инициационной супрессии рака языка. Интрагастральное введение коровьего ЛФ об ладало антиметастазным эффектом у мышей с карциномой 26 (Co 26Lu), причем повышался локальный и системный иммунитет. Клинические испытания выявили, что перорально вводимый коровий ЛФ ингибирует рост аденомных полипов и может уменьшать риск кар циногенеза кишечника у людей [17–18].

Интригующей особенностью биологической активности ЛФ является подтверждаемая рядом данных (in vivo и in vitro) противоположность его эффектов на нормальные и раковые клетки, а именно стимуляция нормальных и подавление раковых клеток. В разработке новых методов профилактики и терапии раз личных заболеваний особое место занимает направление, основанное на использовании регуляторных факторов, вырабатываемых в самих тканях организма. Эти сигнальные молекулы запускают механизмы, препятствующие патологическим изменениям и стимулирующие восстановительные, регенеративные процессы. В этом плане имеются основания полагать, что в организме вырабатываются регуляторные вещества, активизирующие си стему противораковой защиты и даже блокирующие процесс биологического старения. Согласно предложенной О.В. Квиткоразвитийной теории омоложения [19–23], огромные различия в темпе старения, продолжительности жизни видов и скорости развития онкологических заболеваний определяются тем, что более долговечными и онкорезистентными являются организмы с продолжительными периодами физического развития и роста, когда активно продуцируются сигнальные молекулы (в частности, морфогенетические белки), которые наряду с управлением процессами морфогенеза и роста активизируют эпигенетические процессы восстановления физиологически оптимального спектра экспрессии генов [19–23]. Возможность одновременного участия од них и тех же белков в различных процессах подтверждается явлением плейотропии – полифункциональности, т.е. участия одного и того же гена или белка в разных функциях [24]. ЛФ является многофункциональным бел ком, обладающим аффинностью к различным клеточным рецепторам [25–27]. При этом в исследованиях на культурах костных клеток получены данные об участии ЛФ в регуляции морфогенеза и роста костной ткани [28–29], что позволяет считать его одним из морфо генетических факторов. ЛФ синтезируется и накапливается во вторичных гранулах нейтрофилов и присутствует в плазме крови, что обеспечивает его доставку к различным тка ням организма. К положительным эффектам ЛФ при введении в организм относятся подавление микробных инфекций, стимулирование иммунитета, антивоспалительное действие, противоопухолевая активность и ускорение заживления ран. Особый интерес к использованию ЛФ определяется возможностью его получения из та кого доступного источника, как молоко живот ных, в котором он содержится в значительных количествах. При этом уже реализована возможность производства человеческого ЛФ из молока трансгенных животных, в частности коз, что демонстрируется результатами выполнения союзной программы БелРосТрансген [30]. Это открывает перспективу создания вы сокоэффективных и биологически безопасных лекарственных средств и пищевых продуктов на основе ЛФ человека [30].

Материалы и методы

Работа выполнялась на клетках стандартной линии рака легкого А549 и полученной нами иммортализированной линии клеток из эмбриональных фибробластов человека.

Культуры клеток высевали в ростовой среде, включающей среду RPMI (для линии A549) или DMeM (для линий иммортализированных фибробластов человека), 10% эмбриональной сыворотки телят (ЭТС) и антибиотики (пени циллин и стрептомицин).

Для выполнения экспериментов по количественному анализу и компьютерной видеомикроскопии монослойные клеточные культуры трипсинизировали (для отделения от сосуда клетки снимаются 0,25%-ным раствором трипсина), суспендировали с помощью пипетки в ростовой среде, подсчитывали концентрацию клеток в камере Горяева и высевали клетки при низкой плотности (порядка 10 клеток на 1 мм2 ростовой поверхности) в сосуды Карреля со специально изготовленными стеклянными вкладыша ми (рис. 1). Вкладыши имеют размеры 25 × 10 × 1 мм и разделены на квадратные (1 × 1 мм) участки бороздками шириной 0,2 мм и глубиной 0,05 мм. Бороздки препятствуют перемещению клеток из одного квадрата в другой, что обеспечивает удобство анализа роста культуры.

При помощи шприца в сосуд Карреля добавляли CO2 (5% объема сосуда). После добавления СО2 с помощью шприца сосуды Карреля герметически закупоривали резиновыми пробками.  Клетки культивировали в термостате (37 ºС). После распластывания основной части клеток (после 2 дней культивирования) выполняли компьютерное фотографирование клеток на стеклянных вкладышах (по 30 квадратных участков).

Растворы лактоферрина в культуральной среде (10 мг/мл) пропускали через 0,2 μm фильтр и хранили при 4 ºC. Для создания концентрации 1000 мкг/мл из сосуда отбирали 300 мкл среды и вносили 300 мкл концентрата. Соответственно, для создания концентраций 100 и 10 мкг/мл вносили и отбирали 30 и 3 мкл концентрата и среды соответственно, после чего добавляли во флаконы новую порцию углекислого газа и закупоривали флаконы резиновыми пробками. В контрольных сосудах открывали резиновую пробку и вносили новую порцию углекислого газа. В экспериментах с повторным добавлением ЛФ проводили полную смену культуральной среды.

Рис. 1. Стеклянный вкладыш для культивирования
клеток

Через различные интервалы времени выполняли компьютерное фотографирование тех же участков клеточных культур, что и перед добавлением раствора ЛФ (в опытных вариантах) либо воды (в контроле). Фотографирование выбранных участков культур производилось с помощью компьютерного видеокомплекса «Цитомир», изготовленного совместно с НТЦ «Микроскопия» ОАО «Оптоэлектронные системы» ГНПО «Планар» в рамках проекта подпрограммы «Научные приборы» ГКНТ Республики Беларусь.

Результаты и обсуждение

Исследование эффектов рекомбинантного лактоферрина человека на линию рака легкого А549

В первом эксперименте на клетках линии рака легкого А549 после 2, 5 и 8 дней воздействия лактоферрина не было обнаружено достоверных отличий от контроля по количеству клеток (табл. 1). Не было также обнаружено каких-либо качественных изменений. Все культуры достигли высокой плотности клеток, при этом клетки в основном принимали округлую форму.

В следующем эксперименте после 8 дней, прошедших после первого внесения ЛФ, провели смену среды с повторным добавлением лактоферрина в тех же концентрациях. После повторного введения лактоферрина в ряде участков культур количество клеток уменьшалось, а оставшиеся клетки увеличивались в размере и по морфологии отличались от клеток в контроле, приобретая более веретеновидную форму (рис. 2). Но в целом, как видно из табл. 2, не было обнаружено заметного снижения темпов пролиферации раковых клеток в опытных культурах по сравнению с контролем.

Таблица 1

Число клеток линии рака легкого А549 при однократном введении лактоферрина

Концентрация
Лф, мкг\мл
Время после внесения Лф, дни
0 2 5 8
0 (контроль 1) 176 720 2300 2462
0 (контроль 2) 283 799 2435 2495
10 180 557 2245 2405
10 240 730 2335 2445
100 179 481 1500 1855
100 227 710 2050 2128
1000 200 574 1805 1988
1000 215 609 2145 2200

Молекулярная и прикладная генетика. Том 18, 2014 г.

Рис. 2. Участок клеточной культуры линии рака легкого А549: а) в контроле; б) после двукратного введения
лактоферрина в концентрации 100 мкг/мл

Таблица 2

Число клеток линии рака легкого А549 при двукратном введении лактоферрина

Концентрация
Лф, мкг\мл
Время после внесения Лф, дни
0 7 14 21
0 (контроль 1) 720 2323 3223 3390
0 (контроль 2) 311 1470 2370 2520
10 432 1387 1745 2265
10 351 1615 1670 2030
100 377 1360 1723 1995
100 422 1783 2185 2345
1000 413 1440 2220 2625
1000 389 1060 1605 2050

Исследование эффектов рекомбинантного лактоферрина человека на культуру иммортализированной линии фибробластов человека

Так как в предыдущих экспериментах по 1- и 2-кратному введению лактоферрина в культуру линии А549 не удалось выявить заметных эффектов по ингибиции пролиферации раковых клеток, в следующих экспериментах с иммортализированной линией фибробластов человека культуры применяли 3-кратное введение лактоферрина. После клеточного посева в культуральную среду, содержащую лактоферрин, этот белок также вводился в культуры на 12-й и 20-й дни после первого внесения препарата.

В этих экспериментах на поздних сроках культивирования в культурах с концентрациями лактоферрина 100 и 1000 мкг/мл количество клеток резко уменьшилось (табл. 3–4). Ингибирующий эффект возрастал с увеличением концентрации. Во всех культурах с концентрацией лактоферрина 1000 мкг/мл, а также в одной культуре с концентрацией 100 мкг/ мл произошла полная гибель клеток. В остальных культурах с концентрацией 100 мкг/мл наблюдалось резкое уменьшение числа клеток на фоне продолжающегося увеличения числа клеток в вариантах с концентрацией 10 мкг/ мл и контроле.

Таким образом, обнаружено дозозависимое ингибирующее действие рекомбинантного лактоферрина на культуру иммортализированной линии фибробластов человека при продолжительном культивировании клеток после трехкратного введения препарата. Ингибирующий эффект лактоферрина на линию раковых клеток А549 обнаружен не был, что может быть обусловлено недостаточной продолжительностью культивирования клеток в среде, содержащей лактоферин.

По видимому, особенностью действия регуляторного белка лактоферрина на трансформированные клетки является мягкий, растянутый

Таблица 3

Число клеток иммортализированной линии фибробластов человека 
при трехкратном введении лактоферрина

Концентрация Лф,
мкг\мл
Время после внесения Лф, дни
0 5 9 12 16 19 23 27 31 33
0 (контроль 1) 349 1560 2579 4300 8760 15786 16250 16340 16230 15950
0 (контроль 2) 676 2130 5205 9570 15580 15140 14980 15360 15120 14350
10 520 1850 3260 5950 10300 11950 12980 13560 14000 14530
100 511 2400 4980 7980 10960 11360 11400 9780 2230 59
100 545 1239 4250 7670 9345 9980 10260 5600 1450 108
1000 501 974 1912 5141 7379 9670 5980 670 0 0
1000 623 1206 3548 7322 9766 10834 5517 1435 24 0
                     

 

Таблица 4

Число клеток иммортализированной линии фибробластов человека 
при трехкратном введении лактоферрина

Концентрация Лф,
мкг\мл
Время после внесения Лф, дни
0 4 7 11 14 17 21 24 28 31
0 (контроль 1) 301 928 2161 3950 7290 11080 12321 13370 14370 14650
0 (контроль 2) 167 411 1236 2670 5540 8740 12780 14252 15674 15987
10 233 876 2296 4765 7780 9650 10450 10870 11328 11604
10 179 458 1297 3100 6789 8320 9620 10352 11670 12453
100 243 674 1612 3270 5650 6200 6290 5530 2200 120
100 181 398 1078 2980 4800 5660 5900 4320 1290 0
1000 269 732 1689 2980 4550 4907 2970 1780 510 0
1000 179 347 986 1765 1930 1730 301 0 0 0

во времени ингибирующий эффект. В то же время, в литературных данных сообщается о возможном стимулирующем действии лактоферрина на нормальные клетки. Это свойство выгодно отличало бы противораковые препараты на основе лактоферрина от традиционных химиопрепаратов, действующих достаточно быстро, но обладающих нежелательными побочными эффектами на нормальные клетки. Следовательно, в будущих исследованиях целесообразно изучить влияние лактоферрина на культуру нормальных клеток, а также на смешанную культуру нормальных и раковых клеток. Противораковый эффект данного белка на смешанных культурах может быть особенно выраженным за счет синергии подавления раковых клеток и стимулирования нормальных.

Заключение

Изучено воздействие различных концентраций лактоферрина из молока трансгенных коз на пролиферацию и апоптоз клеток линии рака легкого А549 и иммортализированной клеточной линии эмбриональных фибробластов человека.

В экспериментах по изучению действия лак- тоферрина на клеточную линию рака легкого А549 при одно- и двукратном введении препарата не было обнаружено заметного снижения темпов пролиферации. Тем не менее, в некоторых участках культур на поздних сроках куль- тивирования наблюдалось уменьшение числа клеток, а также изменение клеточной морфологии. Отсутствие значительного ингибирующего эффекта лактоферрина в экспериментах на клетках раковой линии A549 может быть обусловлено недостаточно продолжительным воздействием лактоферрина.

При изучении действия лактоферрина на иммортализированной линии эмбриональных фибробластов человека при трехкратном введении в культуру лактоферрин уменьшал количество клеток на поздних сроках культивирования в концентрациях 100 и 1000 мкг/мл, причем ингибирующий эффект возрастал с концентрацией препарата вплоть до полной гибели клеток.

Анализ литературных данных демонстрирует неоднозначность действия лактоферрина на разные типы клеток, вплоть до противоположных эффектов. Это свидетельствует о перспективности изучения эффектов лактоферрина в направлении поиска благоприятных ингибирующих либо стимулирующих воздействий. Представляется целесообразным исследовать влияние лактоферрина на культуру нормальных клеток, а также на смешанную культуру нормальных и раковых (иммортализированных) клеток. Ожидается, что противораковый эффект данного белка на смешанных культурах может быть особенно выраженным за счет синергии подавления трансформированных и стимулирования нормальных клеток.

Список использованных источников

1. Levay, P.F. Lactoferrin: a general review /P.F. Levay, M. Viljoen // Haematologica. 1995. – Vol. 80. – P. 252–267.
2. Nancy, C. Disorders of Iron Metabolism /C. Nancy, M.D. Andrews // N engl J Med. –1999. – Vol. 341. – P. 1986–1995.
3. Vogel, H.J. Lactoferrin, a bird’s eye view /H.J. Vogel // Biochem Cell Biol. – 2012. –Vol. 90, № 3. – P. 233–244.
4. Sanchez, L. Biological role of lactoferrin /L. Sanchez, M. Calvo, J.H. Brock // Arch. Dis.Child. – 1992. – Vol. 67. – P. 657–661.
5. Baldwin, D.A. the effect of human se-rum transferrin and milk lactoferrin on hydroxyl radical formation from superoxide and hydrogenperoxide / D.A. Baldwin, e.R. Jenny, P. Aisen //J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259. – P. 13 391–13 394.
6. Restricted spatiotemporal expression oflactoferrin during murine embryonic devel-opment / P.P. Ward [et al.] // endocrinology. –1999. – Vol. 140. – P. 1852–1860.
7. Masson, P.L. An ironbinding protein com-mon to many external secretions / P.L. Mas-son, J.F. Heremans, C. Dive // Clinica ChimicaActa. – 1966. – Vol. 14. – P. 735–739.
8. Levay, P.F. Lactoferrin: a general review/ P.F. Levay, M. Viljoen // Haematologica. –1995. – Vol. 80. – P. 252–267.
9. Isolation of a lactoferrin cDNA clone and itsexpression in human breast cancer / t. Campbell[et al.] // Br. J. Cancer. – 1992. – Vol. 65. – P. 19–26.
10. Polymorphism and altered methylation ofthe lactoferrin gene in normal leukocytes, leuke-mic cells and breast cancer / t.J. Panella [et al.]// Cancer Res. – 1991. – Vol. 51. – P. 3037–3043.
11. Lactoferrin expression in human breastcancer / S. Penco [et al.] // Cancer Biochem. Bio-phys. – 1999. – Vol. 17. – P. 163–178.
12. Methylation and expression of the lacto-ferrin gene in human tissues and cancer cells /C. teng [et al.] // Biometals. – 2004. – Vol.17. –P. 317–323.
13. expression and prognostic value of lacto-ferrin mRNA isoforms in human breast cancer/ M. Benaissa [et al.] // Int. J. Cancer. – 2005. –Vol. 114. – P. 299–306.
14. Siebert, P.D. Identification of an alterna-tive form of human lactoferrin mRNA that isexpressed differentially in normal tissues and tu-mor-derived cell lines / P.D. Siebert, B.C. Huang// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 94. –P. 2198–2203.
15. Methylation and expression of the lactoferrin gene in human tissues and cancer cells /C. teng [et al.] // Biometals.– 2004. – Vol. 17,№ 3. – P. 317–323.
16. Human lactoferrin inhibits growth of solidtumors and development of experimental metastases in mice / J. Bezault [et al.] // Cancer Res. –1994. – Vol. 54. – P. 2310–2312.
17. Cancer prevention by bovine lactoferrin andunderlying mechanisms – a review of experimentaland clinical studies / H. tsuda [et al.] // Biochem.Cell Biol. – 2002. – Vol. 80, № 1. – P. 131–136.
18. Cancer prevention by bovine lactoferrin:from animal studies to human trial / H. tsuda[et al.] // Biometals. – 2010. – Vol. 23, № 3. –P. 399–409.
19. Квитко, О.В. Развитийная доминанта как механизм антистарения / О.В. Квитко // Альманах геронтологии и гериатрии. – 2005. –Т. 4. – С. 73–77.
20. Квитко, О.В. Генетика долговечности /О.В. Квитко // Наука и инновации. – 2009. –Т. 8, № 78. – С. 18–20.
21. Kvitko, O. Signalling pathways and rejuvenation: risks and opportunities // 11th ScientificSymposium of LVMH Recherche, 2011, 27th October, London UK. – P. 30–33.

Информация

На этом сайте мы собираем информацию и достоверные исследования об уникальном белке - человеческом лактоферрине (HL).

Уже много лет чиновники разных уровней не дают развиваться и всячески пытаются уничтожить результаты работы российских и белорусских исследований по получению рекомбинантного человеческого лактоферрина из молока генномодифицированных коз.

Чтобы содержать стадо и кормить животных создан этот сайт.