Аннотация
Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемым раком среди женщин во всем мире. Здесь рекомбинантный человеческий лактоферрин ( rhLf ), экспрессированный в Pichia pastoris, был протестирован на предмет его потенциальной цитотоксической активности на панели из шести клеточных линий рака молочной железы человека. Цитотоксический эффект rhLf определяли с помощью анализа визуализации HTS в живых клетках. Кроме того, для исследования режима действия rhLf использовались протоколы конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. RHLf показал эффективный CC5091,4 и 109,46 мкг / мл на неметастатических и метастатических клетках MDA-MB-231 с благоприятными значениями индекса селективной цитотоксичности, 11,68 и 13,99 соответственно. Кроме того, rhLf отображал удовлетворительные значения SCI на четырех дополнительных клеточных линиях: MDA-MB-468, HCC70, MCF-7 и T-47D ( 1,55-3,34 ). Кроме того, rhLf спровоцировал образование пузырей на плазменной мембране, конденсацию хроматина и усадку клеток в клетках MDA-MB-231, что является тремя морфологическими изменениями, связанными с апоптозом. Кроме того, rhLf смог сжимать микрофиламенты, образуя перемежающийся цитоплазматический паттерн в клетках MDA-MB-231 и Hs-27, что визуализируется на конфокальных микрофотографиях. Кроме того, выполняя проточный цитометрический анализ, rhLf спровоцировал значительную экстернализацию фосфатидилсерина, остановку клеточного цикла в S-фазе и индуцированную апоптозом фрагментацию ДНК в клетках MDA-MB-231. Следовательно,rhLf обладает селективной цитотоксичностью на клетках рака молочной железы. Кроме того, rhLf вызвал связанные с апоптозом морфологические изменения, нарушение организации цитоскелета F-актина, экстернализацию фосфатидилсерина, фрагментацию ДНК, и остановка прогрессирования клеточного цикла на тройно-отрицательных клетках рака молочной железы MDA-MB-231. Общие результаты показывают, что rhLf использует путь апоптоза в качестве своего механизма для гибели клеток. Результаты гарантируют дальнейшую оценку rhLf как потенциального препарата против рака молочной железы. Общие результаты показывают, что rhLf использует путь апоптоза в качестве своего механизма для гибели клеток. Результаты гарантируют дальнейшую оценку rhLf как потенциального препарата против рака молочной железы. Общие результаты показывают, что rhLf использует путь апоптоза в качестве своего механизма для гибели клеток. Результаты гарантируют дальнейшую оценку rhLf как потенциального препарата против рака молочной железы.
Ключевые слова: Открытие противоракового препарата; Апоптоз; Рак; Клеточный цикл; Цитоскелет; Лактоферрин.
Введение
Лактоферрин (ЛФ), железосвязывающий мономерный гликопротеин, является одним из компонентов врожденной иммунной системы млекопитающих [1]. ЛФ присутствует практически во всех жидкостях организма, достигая максимальной концентрации в колоструме (до 7 мг/мл) и молоке (2 мг/мл) [2]. Свободный Lf, содержащийся в сыворотке крови, слезах, сперме, слюне и других секретах человека [4], рассматривается как нутрицевтик [3], обладает иммуномодулирующей, антимикробной, антиоксидантной и антиканцерогенной активностью [5]. Lf (ранее известный как лактотрансферрин) представляет собой хорошо выраженный гликопротеин с массой около 80 кДа, содержащий около 700 аминокислотных остатков. Однако его длина варьирует по количеству аминокислот в зависимости от вида; человеческий Lf состоит из пептида длиной 711 аминокислот [6].
Рак является второй основной причиной смерти в мире, которую только что обошли сердечно- сосудистые заболевания [7]. В мире примерно каждая шестая смерть вызвана раком [7]. В январе 2016 года в мире насчитывалось более 15,5 млн американцев, страдающих онкологическими заболеваниями [8]. По прогнозам, в 2018 году в США будет диагностировано около 1 735 350 новых случаев рака [8]. Кроме того, ожидается, что в 2018 году от рака умрет около 609 640 американцев, что составляет 1670 смертей в день [8]. Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемым онкологическим заболеванием у женщин во всем мире [7]. В США в 2018 году ожидается выявление около 268 670 новых случаев рака молочной железы: 266 120 женщин и 2550 мужчин. Кроме того, в 2018 году в США прогнозируется 41 400 смертей (40 920 женщин и 480 мужчин) от рака молочной железы [8]. По прогнозам, в 2019 году в США будет диагностировано около 1 762 450 новых случаев рака [8]. Кроме того, ожидается, что в 2019 году от рака умрет около 606 880 американцев, что составляет 1662 смерти в день [8]. Рак молочной железы - наиболее часто диагностируемое онкологическое заболевание у женщин во всем мире [7]. В США в 2019 году ожидается выявление около 271 270 новых случаев рака молочной железы: 268 600 женщин и 2670 мужчин. Кроме того, прогнозируется, что в течение 2019 года в США произойдет 42 260 смертей (41 760 женщин и 500 мужчин) от рака молочной железы [8]. В настоящее время лечение онкологических заболеваний может включать лучевую, химиотерапию и/или хирургическое вмешательство, что влечет за собой серьезный физиологический и психологический ущерб для пациентов, подвергающихся таким процедурам. Учитывая все эти тревожные цифры и нежелательные вторичные эффекты, вызываемые существующими противораковыми препаратами, возникает необходимость поиска и валидации новых эффективных экспериментальных соединений, обладающих противораковой активностью и, более того, оказывающих противораковое действие. В соответствии с вышеизложенным контекстом, Lf изучался для его антиканцерогенное действие [9, 10]. Было показано, что Lf обладает цитотоксической активностью в отношении различных раковых клеток, а биоактивные пептиды, полученные из лактоферрина, способны вызывать программируемую клеточную гибель раковых клеток [11]. Более того, было показано, что Lf вызывает деструктивный эффект в профиле клеточного цикла, способный арестовывать клетки на различных фазах клеточного цикла в зависимости от типа изучаемых раковых клеток [12]. С другой стороны, Lf - молекула, способная хелатировать ионы железа, переносить железо в клетки, а также обладающая противораковой активностью, основанной на ее способности уравновешивать этот ион в крови и внешних выделениях [13]. Ранее было показано, что для роста опухолевых клеток требуются повышенные концентрации железа, а гены, участвующие в поглощении железа, сверхэкспрессированы в опухолевых клетках [14]. Поэтому Lf может быть дополнительно вовлечен в механизмы лекарственной устойчивости рака, связанные с метаболизмом железа [15], а также с индукцией ферроптоза - механизма гибели клеток, связанного с железом [16, 17]. В настоящем исследовании рекомбинантный лактоферрин человека (rhLf), экспрессированный в дрожжах Pichia pastoris, оказывал селективное цитотоксическое действие на клетки тройного негативного рака молочной железы человека при минимальном повреждении нераковых клеток молочной железы. Кроме того, результаты свидетельствуют о том, что rhLf использует апоптотический путь в качестве механизма проявления своей цитотоксической активности, что подтверждается провоцированием клеточных морфологических изменений, связанных с апоптозом, таких как: разрушение микрофиламентов F-актина, экстернализация фосфатидилсерина, фрагментация ДНК, вызванная апоптозом, и изменение нормальной прогрессии клеточного цикла. Полученные результаты открывают панораму возможностей для создания новых природных фармакологических альтернатив у онкологических больных.
Материалы и методы
Ферменты, штаммы и условия культивирования
Все ферменты рестрикции были приобретены в компании Invitrogen® (Carlsbad, CA, USA). В качестве хозяина для размножения плазмид использовалась Escherichia coli (E. coli) BL21DE3 (Invitrogen®). Для экспрессии белка использовали культуру Pichia pastoris (P. pastoris) X33 (предоставлена CIAD, Cd. Cuauhtémoc, Chih. Mexico). E. coli BL21DE3 культивировали при 37 °C в бульоне Лурии-Бертани (LB) (10 мг/л триптона, 5 мг/л дрожжевого экстракта, 10 мг/л NaCl) и на пластинах LB (15 мг/мл агара) с добавлением цеоцина (25 мкг/мл) в качестве селективного маркера. P. pastoris культивировали при 30 °C и 250 об/мин на бульоне YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% декстрозы) и пластинах YPD (20 мг/мл агара), дополненных цеоцином (200 мг/л) в качестве селективного маркера.
Клонирование гена лактоферрина человека (HLF1) и трансформация P. pastoris
Ген HLF1 состоит из открытой рамки считывания (ORF) размером 2331 п.н., кодирующей полипептид длиной 711 аминокислот с предсказанной молекулярной массой 78,4 кДа и расчетным PI 8,12 (Protein calculator v3.4 http:// protcalc.sourceforge.net/cgi-bin/protcalc). Ген лактоферрина человека (номер доступа в GeneBank M83202.1; выделен из ткани молочной железы 8- месячной беременной женщины) был модифицирован in silico с помощью программы SnapGene® 4.1.9 для оптимизации использования кодонов в P. pastoris; также были сделаны тихие точечные мутации для устранения нежелательных сайтов рестрикции и добавлена шестигистидиновая метка на карбоксильном конце последовательности. In silico модифицированная последовательность лактоферрина человека была направлена в компанию GenScript® (Piscataway, NJ, USA) для клонирования в вектор pPICZα (Invitrogen®) и получения генетической конструкции pIGF5 (Iglesias- Figueroa-IGF). Генетическая конструкция была трансформирована в Компетентные клетки E. coli BL21DE3, и шесть предполагаемых клонов были проверены с помощью ферментативного рестрикционного анализа ДНК. После определения характеристик один из отобранных клонов был линеаризован с помощью SacI, и 500 нг линеаризованной ДНК использовали для трансформации Электрокомпетентные клетки P. pastoris X33. Трансформацию проводили с помощью микропульсатора BioRad (BioRad, Hercu- les, CA, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Через 3 дня инкубации в присутствии селективного маркера (200 мг/л цеоцина) для анализа были выделены клоны, устойчивые к цеоцину.
Молекулярный анализ и индукция экспрессии белка rhLf
Колонии Pichia pastoris, несущие интересующую плазмиду, отбирались по маркеру устойчивости к цеоцину. Дополнительно для подтверждения наличия гена hLf в отобранных по цеоцинорезистентности колониях проводили ПЦР одной колонии. Колонию дрожжей, превосходящую два требования отбора, выращивали в бульоне YPD (10% дрожжевого экстракта, 20% пептона и 20% D-глюкозы), содержащем 200 мг/мл цеоцина, при 30 °C при 250 об/мин в течение 24 ч. Затем клетки собирали центрифугированием и инкубировали при плотности посева 0.1-0,2 оптической плотности (OD) в среде BMMY [100 мМ фосфата калия, pH 6,0, 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 1,3% дрожжевого азотистого основания (YNB), 400 мкг/л биотина и 0,5% метанола] для индукции экспрессии rhLf. Для поддержания индукции метанол добавляли до конечной концентрации 0,5% (v/v) каждые 24 ч в течение 96 ч в соответствии с методом, описанным в [18]. Через 96 ч клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4 °С, супернатант культуральной среды собирали и проверяли на наличие секреции rhLf с помощью 12% SDS-PAGE.
Очистка белков и вестерн-блот анализ
Супернатант дрожжевой культуры диализовали против PBS pH 7,4 в течение 24 ч. После диализа белковые экстракты очищали с помощью высокоаффинной Ni-заряженной смолы (GenScript®) в соответствии с инструкцией производителя для получения очищенного белка rhLf. Содержание эндотоксинов в очищенном rhLf определяли с помощью набора ToxinSensor TM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript®), способного определять до 0,25 EU/mL в соответствии с инструкцией производителя. Очищенный rhLf кипятили с 1 × загрузочным буфером в течение 5 мин и разделяли в SDS-PAGE в 12%-ном разрешающем и 5%- ном расслаивающем акриламидном геле. Разделенные с помощью электрофореза белки окрашивали Coomassie Brilliant Blue R-250 для определения уровня экспрессии белков. В качестве молекулярно-массовых стандартов использовали предварительно окрашенные белки-маркеры для вестерн-блот анализа (20-250 кДа, Inv- itrogen). После электротрофореза разделенные белки переносили с гелей на микропористую мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ) (Pierce, Rockford, IL, USA) и блокировали в течение ночи при 4°С 5%- ным (w/v) бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворенным в трис-буферном солевом растворе (TBS). После этого блот был инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичным антителом анти-6X His tag кроличьим поликлональным антителом (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD USA) в разведении 1:1000 в 5%- ном обезжиренном молоке в TBS-T (0,001% Tween) в течение ночи при 4 °C. Несвязанные антитела отмывали TBS-T три раза по 15 мин, затем добавляли вторичное антитело (поликлональное козье анти- раббит, конъюгированное с пероксидазой хрена; Thermo Scientific) в разведении 1:10000 в TBS-T и дополнительно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанные антитела снова отмывали TBS-T 3 раза по 15 мин. Затем добавляли субстрат ECL (Thermo Scientific) и подвергали мембрану хемилюминесцентной детекции (система визуализации iBright FL1000; Thermo Scientific).
Клеточные линии и условия культивирования клеток
Все семь клеток млекопитающих, использованных в данной работе, были получены из тканей человека и получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA), за исключением MDA-MB-231/LM2-4, которая была щедро подарена профессором Джулио Франсиа из UTEP [19]. Трижды негативный рак молочной железы человека MDA-MB- 231 [19], его метастатический вариант MDA-MB- 231/LM2-4 [20], трижды негативный рак молочной железы MDA-MB-468 [21] и нераковые фибробласты человека Hs27 выращивали в среде DMEM (Corning, Corning, NY), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS: Corning), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life Technologies, Grand Island, NY). Клеточная линия рака молочной железы MCF-7 [22], положительная по эстрогеновым (ER+ ), прогестероновым (PR+ ) и глюкокортикоидным рецепторам (GR/NR3C1+ ), выращивалась как четыре вышеперечисленные клеточные линии, с добавлением 10 мкг/мл инсулина. Клетки тройного негативного рака молочной железы HCC70 [23] поддерживали в среде RPMI (Thermo Fisher Scientific Inc.), дополненной 10% FCS и пенициллином/стрептомицином. Плохо метастазирующие клетки рака молочной железы T- 47D [24], имеющие рецепторы эстрогена и прогестерона (ER+ и PR+ ), культивировали как HCC70 с добавлением 0,2 Ед/мл инсулина. Человеческий неопухолевый эпителиальный Клетки линии MCF-10A, полученные из молочной железы [25], использованные в качестве контроля, культивировали в среде DMEM/F12 (Life Technologies), дополненной 10% FBS, 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина (Sigma), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (Pep- rotech, Rocky Hill, NJ, USA), 0.5 мкг/мл гидрокортизона (Sigma), 2,5 мМ L-глютамина (Life Technologies), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life Technologies), как описано ранее [26]. Все клеточные линии рака молочной железы были получены от женщин-доноров и использовались для экспериментов по цитотоксичности [27], в то время как клеточная линия Hs27 была получена от мужчин-доноров и использовалась только для анализа цитоскелета. Условия роста для всех клеток были одинаковыми - 37 °С в увлажненной 5% CO2 атмосфере. Клетки для обеспечения высокой жизнеспособности готовили в соответствии с ранее рекомендованными способами [28].
Дифференциальное окрашивание ядер (DNS) для определения цитотоксической активности rhLf
Все клеточные линии рака молочной железы (табл. 1), растущие в среднеэкспоненциальной фазе (60-70% конфлюэнтности), промывали свежей средой, чтобы удалить мусор и плавающие клетки, которые в основном соответствуют мертвым клеткам. Затем адгезивные (живые) клетки отделяли путем добавления 0,25% раствора трипсина (Invitro- gen, Carlsbad, CA), разводили в бессывороточной среде DMEM и инкубировали в течение примерно 10 мин при 37°С [29]. После сбора клетки подсчитывали с помощью камеры Нейбауэра и высевали в 96-луночные планшеты для культуры тканей при плотности 10 000 клеток в 100 мкл/лунку полной среды с последующей инкубацией в течение ночи. Затем клетки обрабатывали 5, 10 и 50 мкг/мл rhLf в течение 24 ч. Одновременно в эту серию экспериментов включали следующие контроли: 5% v/v H2 O в качестве контроля растворителя, необработанные клетки и в качестве положительного контроля цитотоксичности - клетки, обработанные 2 мМ H O22 . Для определения процента гибели клеток использовали метод дифференциального ядерного окрашивания (ДЯО) [26, 28, 30, 31]. Вкратце, использовались два флуоресцентных ДНК- связывающих красителя: Hoechst 33342 (Invitrogen, Eugene, OR) - проницаемый для клеточных мембран флуорофор, маркирующий живые и мертвые клетки, что позволяет определить общее количество клеток, и пропидий
Таблица 1 50%-ная цитотоксическая концентрация (CC50 ), достигнутая rhLf в отношении шести раковых и одной нераковой клеточных линий молочной железы, и индекс селективной цитотоксичности (SCI).
| Клеточная линия |
CC50 (мкг/мл) |
SCIa |
| MDA-MB-231b |
109.46 |
11.68 |
| MDA-MB-231 LM2-4c |
91.4 |
13.99 |
| MDA-MB-468d |
491.8 |
2.60 |
| HCC70e |
823.6 |
1.55 |
| MCF-7f |
382.2 |
3.34 |
| T-47Dg |
491.5 |
2.60 |
| MCF-10Ah |
1279.4 |
|
a Индекс селективной цитотоксичности (SCI) определяли следующим образом: SCI = CC50 нераковых клеток/CC50 раковых клеток, как описано ранее [20].
b Клеточная линия тройного негативного рака молочной железы
c Метастатический вариант легких (МЛ), полученный из клеток MDA-MB-231 [19]
d Клеточная линия тройного негативного рака молочной железы человека MDA-MB-468
e Клеточная линия тройного негативного рака человека HCC70
f Клеточная линия рака молочной железы человека MCF-7 с рецепторами эстрогенов, прогестерона и глюкокортикоидов
g Клеточная линия рака молочной железы человека с рецептором прогестерона T-47D
h Нераковая эпителиальная линия клеток человека MCF-10A из тиса молочной железы использовалась в качестве контрольной для определения SCI.
Анализ клеточных морфологических изменений, индуцированных rhLf
Клетки MDA-MB-231, растущие на чашках, как описано выше, обрабатывали 50 мкг/мл рчЛф и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки окрашивали, как указано выше, с использованием анализа DNS, и изображения получали в режиме живых клеток с использованием конфокального микроскопа (LSM 700; Zeiss, New York, NY). Кроме того, для целей сравнения были получены конфокальные изображения необработанных клеток. Были получены три отдельных изображения: светлое поле (дифференциальный интерференционный контраст, DIC), каналы Hoechst и PI с использованием программного обеспечения Zen 2009 (Zeiss), специально разработанной программы для помощи конфокальному микроскопу.
Подготовка микропланшетов для определения влияния rhLf на архитектуру цитоскелета
Для этой серии экспериментов использовали конфокальный микроскоп и клеточные линии человека MDA-MB-231 и Hs27. Прежде чем приготовить экспериментальный 96-луночный планшет, клетки обрабатывали, как описано выше, и высевали при плотности 2500 клеток в 100 мкл/лунку полной среды; на этот раз 96 многолуночных планшетов представляли собой оптически прозрачные планшеты для визуализации, обработанные тканевой культурой (BD Falcon, кат. № 353219). Поскольку для получения изображений использовался объектив с большим увеличением, лунки, расположенные по внешнему периметру планшета, не использовались. Затем микропланшеты инкубировали в течение ночи для ускорения прикрепления клеток. Затем клетки MDA-MB-231 инкубировали со 100 мкг/мл (CC 50 ) rhLf в течение 2 и 4 часов соответственно. В качестве контроля клетки фибробластов человека Hs27 инкубировали с 100 мкг/мл rhLf. Контроли, включенные в эту серию экспериментов, были следующими: 5 мкг/мл цитохалазина D, ингибитора полимеризации актина; 1 мкМ паклитаксела в качестве ингибитора деполимеризации тубулина; 1 об.% ДМСО и 5 об.% H 2 O в качестве контроля растворителя; и необработанные клетки.
Протокол фиксации клеток и окрашивания цитоскелета
По окончании времени инкубации, не удаляя питательную среду, в каждую лунку осторожно добавляли по 100 мкл свежеприготовленного 8% формальдегида в качестве фиксирующего раствора, достигая конечной концентрации формальдегида 4%, и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Затем фиксирующий раствор удаляли и в каждую лунку добавляли по 200 мкл 0,1% Твина 20 об./об. в PBS для промывки и пермеабилизации и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Были проведены две дополнительные промывки последним раствором (0,1% Твин 20 в PBS). В целях блокирования после удаления пермеабилизирующего раствора 200 мкл 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma), растворенного в буфере TBS-T (трис-буферный физиологический раствор, содержащий 0,5% об./об. Твин-20), были добавляли в лунку и инкубировали в течение 1 ч на качающейся платформе или вращающемся устройстве при комнатной температуре. Затем клетки подвергали тройному окрашиванию 50 мкл 0,1% об/об раствора Tween 20 PBS на лунку, содержащего 5 мкг/мл DAPI (Invitrogen), 0,165 мкМ конъюгированного с Alexa Fluor 568 фаллоидина (Invitrogen) и 0,5 мкг /мл конъюгированного с Alexa Fluor 488 моноклонального антитела против α-тубулина (клон DM1A; Thermo Fisher Scientific, Рочестер, Нью-Йорк) путем инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте на качающейся платформе. Таким образом, маркируются ядра, актиновые микрофиламенты (F-актин) и микротрубочки (полимеризованный тубулин) соответственно. Затем клетки трижды промывали по 200 мкл пермеабилизирующего раствора, как описано выше; в конце в лунке оставалось 200 мкл пермеабилизирующего раствора. Затем изображения были зафиксированы в трех каналах флуоресценции (Alexa-488, Alexa-568 и DAPI) с использованием конфокального микроскопа (LSM-700; Zeiss), оснащенного масляным DIC-объективом EC Plan-Neofluar 40x/1,30 [32 ] . Если сигналы флуоресценции рассеивались или фотообесцвечивались, можно было повторно окрасить клетки, используя ту же смесь, что описана выше, снова получив очень яркие сигналы. В течение всего процесса клетки ни разу не были сухими.
Анализ пути апоптоза/некроза с помощью анализа аннексина V-FITC/PI
Клетки MDA-MB-231, высеянные с плотностью 100 000 клеток на лунку в 1 мл полной среды с использованием 24-луночного планшета (BD Falcon), инкубировали в течение ночи, чтобы способствовать прикреплению клеток и возобновлению манипуляций с клетками. Затем к клеткам добавляли 100 мкг/мл рчЛф и инкубировали в течение 24 часов. В этой серии экспериментов в качестве контроля были включены 5% об./об. растворителя H 2 O, необработанные клетки и в качестве положительного контроля апоптоза клетки, обработанные 2 мМ H 2 O 2 . После того как эти клетки собирали и промывали охлажденным льдом PBS в проточной цитометрической пробирке, их подвергали двойному окрашиванию путем ресуспендирования их в 100 мкл связывающего буфера, содержащего аннексин V-FITC и PI, в соответствии с рекомендациями производителя (Beckman Coulter, Майами, Флорида). Вкратце, после осторожной гомогенизации клетки, ресуспендированные в растворе окрашивающей смеси, инкубировали на льду в течение 15 минут в темноте, а затем добавляли 300 мкл ледяного связывающего буфера и немедленно анализировали с помощью проточного цитометра (Gallios, Beckman). Коултер) [ 33 ]. Для каждого образца было получено примерно 10 000 событий (клеток). Двухпараметрические точечные диаграммы проточной цитометрии, разделенные на четыре квадранта, использовали для определения процентных значений апоптоза и некроза. Для этого детекторы FL1 и FL2 располагались вдоль оси x и y соответственно. Для интерпретации четырех субпопуляций, полученных в результате этого типа анализа, обратитесь к следующим публикациям [ 26 , 34 ]. Все экспериментальные точки и контрольные были выполнены в четырехкратной повторности. Сбор и анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter).
Исследование влияния рчЛф на профиль клеточного цикла с помощью содержания клеточной ДНК и проточной цитометрии.
Клетки MDA-MB-231, высеянные с плотностью 25 000 клеток/лунка в 1 мл полной среды, подвергались воздействию 6,76 и 9,48 мкг/мл rhLf в течение 72 часов; Для этой цели использовали 24-луночные планшеты. Затем плавающие и прикрепившиеся клетки (отделенные трипсином) собирали, центрифугировали и осторожно ресуспендировали в 100 мкл PBS. Затем добавляли 200 мкл раствора ядерной среды выделения (NIM)-4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (NIM-DAPI; Beckman Coulter) и немедленно обрабатывали с помощью проточной цитометрии [26 , 35 ] . Приблизительно 20 000 событий было зарегистрировано на образец с использованием проточного цитометра, оснащенного лазером 405 нм (Gallios; Beckman Coulter), одиночным клеточным гейтом и детектором FL9. Анализ распределения фаз клеточного цикла осуществляли с помощью программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter) путем установки четырех ворот на гистограммах каждого отдельного параметра: в качестве индикатора индуцированной апоптозом фрагментации ДНК, суб-G0/G1, гиподиплоид; G0/G1 – диплоид; S — гипердиплоид; и G2/M, тетраплоид [ 34 ]. Для каждой экспериментальной точки и связанного с ней контроля было выполнено четыре реплики.
Анализ индекса селективной цитотоксичности
Индекс селективной цитотоксичности (SCI) для rhLf рассчитывали следующим образом: SCI = CC 50 нераковых клеток, деленный на CC 50 раковых клеток. SCI означает способность экспериментального соединения эффективно убивать раковые клетки с минимальной токсичностью для нераковых клеток [ 26 ]. Значения SCI 1 или меньше указывают на отсутствие селективной цитотоксичности, тогда как значения SCI больше 1 указывают на преимущественную селективную токсичность экспериментального соединения в отношении раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками [26 ] . Значения SCI > 1 весьма желательны для любого потенциального противоракового соединения.
Статистический анализ
Двусторонний парный критерий Стьюдента использовался для определения статистической значимости двух экспериментальных выборок ( http://studentsttest.com/ ). Значение P <0,05 считалось значимым для обозначения того, имеет ли сравнение двух методов лечения статистическую значимость. Результаты представлены как средние значения с соответствующим стандартным отклонением.
Плазмидная конструкция и очистка rhLf
После трансформации P. Pastoris pIGF5, несущим ген hLf (), выбранную колонию выращивали в культуральном бульоне (см. «Материалы и методы»), супернатант собирали, диализовали и очищали с использованием аффинной колонки с высокоаффинной смолой, заряженной Ni. Аликвоту очищенного rhLf анализировали с помощью SDS-PAGE. После окрашивания Кумасси синим было подтверждено наличие полосы около 80 кДа, что соответствует молекулярной массе человеческого лактоферрина (). Кроме того, наличие единственной гомогенной полосы, эквивалентной молекулярной массе hLf (~ 80 кДа), было подтверждено с помощью антитела против его метки и вестерн-блот-анализа (). Эти результаты показывают, что экспрессия и очистка свободного эндотоксина rhLf из P. Pastoris были завершены и пригодны для проведения дальнейших биологических экспериментов.
Открытую рамку считывания hLf (ORF; 2136 п.н.) клонировали в вектор pPICZα (Invitrogen), фланкированный сигналом секреции α-фактора и меткой 6xHis на 5'- и 3'-конце соответственно. Кроме того, было введено несколько молчащих точечных мутаций для устранения нежелательных сайтов рестрикции, они обозначены вертикальными стрелками, включая замену нуклеотидов и положение (bp) в последовательности ORF rhLf. Полученная плазмида была названа pIGF5 (IGF-Iglesias Figueroa). AOX1, промотор алкогольоксидазы 1 из P. Pastoris . Ген BleoR обеспечил устойчивость к зеоцину, селективному антибиотику для трансформации.
Анализ экспрессии и очистки белка rhLf выявил наличие белка массой ~ 80 кДа как с помощью SDA-PAGE ( а ), так и вестерн-блоттинга ( b ). Меченный гистидином (6x) белок rhLf, экспрессированный в клоне P.pastoris , очищали из супернатанта культуры дрожжей с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным никелем. После электрофореза акриламидный гель окрашивали бриллиантовым синим Кумасси ( а ) и после вестерн-блоттинга подвергали воздействию анти-his-меточного антитела ( б ): 1 — маркеры молекулярной массы (ММ) в кДа; 2 — коммерческий бычий лактоферрин; 3 - белок rhLf, меченный гистидином (6x), частично очищенный; 4 — белковые экстракты культурального супернатанта нетрансформанта P.pastoris , использованные в качестве отрицательного контроля.
Определение 50% цитотоксической концентрации рчЛф в клеточных линиях, полученных из молочной железы человека
Цитотоксичность, вызванную градиентом концентрации очищенного белка rhLf на клеточных линиях MDA-MB-231, MDA-MB-231 LM2-4 и MCF-10A, определяли количественно после 24 ч инкубации. ВИзображены проценты цитотоксичности и репрезентативные изображения живых и мертвых клеток, использованные для количественной оценки этого процента экспериментальной цитотоксичности, опосредованной соединениями, в клетках MDA-MB-231. В эту серию экспериментов были включены только клетки, полученные от женщин-доноров, чтобы избежать гендерных различий [ 27 , 36 , 37 ]. Для этой цели использовался анализ DNS живых клеток, проверенный для инициатив высокопроизводительного скрининга [ 28 ], и система биоимиджера IN Cell (GE Healthcare). Чтобы исключить фон гибели клеток, присущий манипуляциям с культурой клеток, данные нормализовали путем вычитания из каждого экспериментального значения процента гибели клеток, полученного из клеток, обработанных контрольным растворителем (H 2 O), с последующим расчетом CC 50 посредством линейной интерполяции . ( https://www.johndcook.com/interpolator.html ). Результаты показывают, что значения rhLf CC 50 из клеточных линий MDA-MB231 и MDA-MB-231 LM2–4 были самыми низкими и составляли 109,46 и 91,4 мкг/мл и соответственно (). Кроме того, в двух дополнительных тройно-отрицательных клетках, MDA-MB-468 и HCC70, значения rhLf CC 50 составили 491,8 и 823,6 мкг/мл соответственно (). Кроме того, значения CC 50 rhLf из клеток MCF-7 составляли 382,2 мкг/мл, тогда как значения CC 50 из клеток T-47D составляли 491,5 мкг/мл (). Кроме того, rhLf CC 50 , полученный из нераковых эпителиальных клеток MCF-10A, составлял 1279,48 мкг/мл, что является самым высоким показателем по сравнению со всеми клетками рака молочной железы, проанализированными в этом исследовании (). Кроме того, rhLf продемонстрировал благоприятный индекс селективной цитотоксичности (SCI) на всех шести протестированных клетках рака молочной железы, наиболее эффективный из которых составлял 11,68 и 13,99 для неметастатических клеток MDA-MB-231 и метастатических клеток MDA-MB-231-LM2–4. соответственно (). Таким образом, rhLf оказался одинаково эффективным на неметастатических клетках MDA-MB-231 и метастатических MDA-MB-231-LM2-4 с высокими благоприятными значениями SCI (более 11) по сравнению с нераковыми клетками молочной железы. производные клеток MCF-10A (). На основании вышеизложенных данных и в связи с тем, что она является прототипом для изучения низкодифференцированного гормонально-независимого рака молочной железы, для следующей серии экспериментов была выбрана клеточная линия MDA-MB-231.
rhLf индуцирует цитотоксичность в отношении клеток MDA-MB-231 дозозависимым образом. Клетки подвергали воздействию градиента концентрации рчЛф и инкубировали в течение 24 часов. Для определения процентной доли цитотоксичности (ось a ; y ) использовали анализ дифференциального ядерного окрашивания и систему биоимиджера . Когда экспериментальные образцы сравнивались с растворителем, 5% об./об. H 2 O, (*) и необработанными контрольными клетками (‡), значения P составляли <0,0001 и <0,0001 соответственно ( a ). Клетки, обработанные 2 мМ H 2 O 2, использовали в качестве положительного контроля цитотоксичности ( a, e ). Каждая экспериментальная точка представляет собой среднее значение четырех реплик и планок ошибок, соответствующих их стандартному отклонению ( a ). Часть репрезентативных изображений живых клеток, объединяющих каналы Hoechst и йодида пропидия (PI), используемых для получения цитотоксической активности, изображена на b – e . Ядра, демонстрирующие синий сигнал, считаются живыми клетками, тогда как ядра, имеющие пурпурный цвет вследствие сигнала колокализации Hoechst и PI, считаются мертвыми клетками ( b – e ). Цитотоксическая концентрация 50% (CC 50 ; в мкг/мл) определяется как концентрация лактоферрина, необходимая для разрушения плазматической мембраны 50% клеточной популяции после 24 часов инкубации. CC 50 рассчитывался посредством линейной интерполяции ( https://www.johndcook.com/interpolator.html ).
Анализ клеточных морфологических изменений, вызванных рчЛф на раковых клетках MDA-MB-231
Трижды негативные клетки рака молочной железы MDA-MB-231, растущие в 96-луночных планшетах, обрабатывали 50 мкг/мл rhLf в течение 24 часов с последующим анализом Hoechst и PI DNS. Чтобы отслеживать морфологические изменения клеток, изображения снимали в режиме живых клеток с помощью конфокального микроскопа. Результаты показывают, что рчЛф вызывает гибель клеток, провоцируя морфологические изменения, связанные с апоптозом в клетках MDA-MB-231, такие как сморщивание клеток, пузырение и конденсация ядер.–). Интересно, что внутри пузырей визуализировался флюоресцентный сигнал (красноватый), скорее всего, из-за наличия небольших фрагментов ДНК, которые высвобождались из ядер в цитоплазму и образовывали комплексы с ФИ (,). Это наблюдение предполагает, что рчЛф также способен вызывать апоптоз-индуцированную фрагментацию ДНК. В целях сравнения изображения живых клеток из необработанных/здоровых клеток MDA-MB-231 показаны на рисунке.–. Таким образом, судя по клеточным морфологическим изменениям, оказывается, что рчЛф использует путь апоптоза в качестве механизма проявления своей цитотоксичности.
rhLf вызывает гибель клеток, фрагментацию ДНК и морфологические изменения, связанные с апоптозом, в тройных негативных клетках рака молочной железы MDA-MB-231. Клетки подвергали воздействию 50 мкг/мл rhLf в течение 24 часов и дважды окрашивали Hoechst и PI. Изображены репрезентативные изображения конфокальной микроскопии живых клеток, полученные с использованием канала Хехста (ядра; а ), дифференциально-интерференционного контраста светлого поля (DIC; b ), канала йодида пропидия ( c ) и наложения предыдущих трех изображений ( d ). Черные стрелки указывают на образование пузырей, тогда как красные стрелки обозначают сокращение клеток и конденсацию хроматина, мертвые клетки, PI-положительный результат. Кроме того, стрелка с белой головкой указывает на клетку с неконденсированным ядром, отсутствием усадки клеток и образованием пузырьков, а также PI-отрицательную клетку, следовательно, живую клетку. Кроме того, как указано выше, изображения живых клеток из необработанных клеток изображены следующим образом: e канал Хехста (ядра); f светлое поле; g йодистый пропидий канал; и наложение предыдущих трех изображений ( h ). Масштабная линейка = 10 мкм
рчЛф провоцирует изменение структуры цитоскелета
На основании вышеизложенных результатов с помощью иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии было проанализировано потенциальное возмущающее действие рчЛф на два основных полимеризованных белка, образующих структуру цитоскелета, актиновые микрофиламенты и тубулиновые микротрубочки. Для этого использовали клеточные линии MDA-MB-231 и Hs27. Включение человеческих фибробластических клеток Hs27 в качестве контроля было обусловлено их морфологией, которая больше и более плоская, чем клетки, полученные из молочной железы, а их отростки удлинены. Поэтому изменения в структуре их цитоскелета легче обнаружить визуально. Клетки в 96-луночных планшетах подвергали воздействию rhLf с последующей фиксацией формальдегидом, пермеабилизацией Tween 20 и процедурами блокирования BSA. Затем в один этап клетки окрашивали антитубулином-Alexa 488 (зеленый; микротрубочки), фаллоидином-Alexa 568 (красный; микрофиламенты) и DAPI (синий; ядра). Впоследствии изображения были получены по трем отдельным каналам в соответствии со спецификациями флуорофора. Через 2 часа после обработки rhLf клеток MDA-MB-231 было замечено, что актиновая нитевидная форма исчезла. Однако было обнаружено, что сигнал Alexa-568 образует обильный пунктирный рисунок, тонко распределенный по всей цитоплазме клеток (белые стрелки обозначают только три из этих агрегаций актина;; канал Алекса-568). Кроме того, размер клеток оказался таким же, как и у контрольных клеток после 2 часов воздействия (,,). С другой стороны, структура микротрубочек клеток MDA-MB-231, по-видимому, не подвергалась влиянию rhLf (). Тем не менее, после 4 часов воздействия rhLf дезорганизация актиновых нитей была более выражена, образуя более крупные и яркие аморфные кластеры F-актина (красные), рассматриваемые как агресомы [ 38 , 39 ], локализованные к периферии клеток, по сравнению с клеток, обработанных в течение 2 ч рчЛф, а также контрольных клеток (,,,,). Одновременно с этим через 4 часа инкубации наблюдалось сокращение цитозоля (4 часа;; канал Алекса-568). На данный момент разрушение микрофиламентов F-актина, спровоцированное rhLf на клетках MDA-MB-231, напоминает профиль изменений, индуцированных цитохалазином D (,; канал Alexa-568), что также вызывало большую цитоплазматическую агрегацию F-актина. Однако эти агрегаты F-актина, индуцированные цитохалазином D на MDA-MB-231, в основном локализовались в периферическом пространстве ядра (; Канал Alexa-568 и объединенное изображение). При анализе влияния рчЛф на фибробласты Hs-27 наблюдалась картина, аналогичная обнаруженной в клетках MDA-MB-231, с потерей организации актиновых микрофиламентов и обильными пунктирными кластерами F-актина в цитоплазме (белые стрелки;; канал Алекса-568). В клетках Hs-27, обработанных rhLf, как и в случае с MDA-MB-231, организация микротрубочек визуально не изменилась (; канал Алекса-488). Как и ожидалось, клетки Hs-27, обработанные цитохалазином D, демонстрировали искаженную организацию микрофиламентов, провоцируя образование цитоплазматических агресом F-актина (белые стрелки;; канал Алекса-488). Как и ожидалось, клетки MDA-MB-231 и Hs-27, обработанные паклитакселом, показали укорочение микротрубочек без нарушения их нитевидной формы (,; каналы Alexa-488) или уменьшение размера ячейки. Кроме того, паклитаксел вызывал образование пузырей на клетках MDA-MB-231 (; белые стрелки). Соответственно, обработанные ДМСО, обработанные H 2 O и необработанные контрольные клетки демонстрировали неизмененную организацию как микрофиламентов, так и структуры микротрубочек F-актина (,,,,,; соответственно). Таким образом, эти анализы показали, что rhLf провоцирует дезорганизацию архитектуры цитоскелета путем изменения сети микрофиламентов F-актина, о чем свидетельствует исчезновение нитчатого актина (F-актина) одновременно с образованием агресом как в MDA-MB-231, так и в Hs27. клетки. Более того, повышенные изменения в агрегации пунктуированных филаментов F-актина, вызванные rhLf, происходили в зависимости от времени на клетках MDA-MB-231.
rhLf нарушил организацию F-актинового (нитевидного) цитоскелета клеток MDA-MB-231. Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии клеток MDA-MB-231, тройно окрашенных фаллоидином, конъюгированным с Alexa-568, антитубулином Alexa-488 и DAPI, демонстрирующие микрофиламенты (актин; канал Alexa-568) и микротрубочки (тубулин; Alexa). -488 канал) организации и ядра (синий канал) соответственно. Клетки обрабатывали следующим образом: а - рчЛф в течение 2 ч; б в течение 4 часов с рчЛф; в с цитохалазином D; г необработанный; e с контролем растворителя H 2 O; f с паклитакселом; г с контролем растворителя ДМСО. Левый столбец изображений соответствует микрофиламентам F-актина (красный), а центральный столбец — микротрубочкам (зеленый), а правый столбец — объединенным изображениям каналов Alexa-568 и Alexa-488 с каналом DAPI (синий; ядра).
rhLf нарушал организацию F-актинового (нитевидного) цитоскелета клеток Hs27. Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии клеток Hs27, тройно окрашенных фаллоидином, конъюгированным с Alexa-568, антитубулином Alexa-488 и DAPI, демонстрирующие микрофиламенты (актин; канал Alexa-568) и микротрубочки (тубулин; канал Alexa-488) организация и ядро (синий канал). Клетки обрабатывали следующим образом: а - рчЛф; б с цитохалазином D; в) необработанный; d с контролем растворителя H 2 O; е с паклитакселом; f с контролем растворителя ДМСО. Левый столбец изображений соответствует микрофиламентам F-актина (красный), микротрубочкам центрального столбца (Alexa-488), а правый столбец - объединенным изображениям каналов Alexa-568 и Alexa-488 с каналом DAPI (синий; ядра).
rhLf вызывает экстернализацию фосфатидилсерина на клетках MDA-MB-231, полученных из рака молочной железы
Механизм действия рчЛф был изучен более подробно путем анализа раннего биохимического события в клетках, подвергающихся апоптозу, - экстернализации фосфатидилсерина (ПС) во внешний листок плазматической мембраны; ранний признак апоптоза [ 40 ]. Клетки MDA-MB-231 обрабатывали rhLf (100 мкг/мл) в течение 24 часов с последующим окрашиванием аннексином V-FITC и PI, а затем сигнал их флуоресценции контролировали с помощью проточной цитометрии [29 ] . Как и ожидалось, рчЛф преимущественно вызывал апоптоз (28,3%) по сравнению с некрозом (0,85%) в клетках MDA-MB-231 (). Кроме того, после того как процент апоптоза в клетках, обработанных rhLf, сравнили с клетками, обработанными H 2 O, и необработанными клетками, значения P составили 0,004123 и 0,002712 соответственно (). Клетки, обработанные контрольным растворителем (H 2 O), и необработанные клетки не показали существенного увеличения как процента апоптоза, так и некроза (). Как и ожидалось, клетки, обработанные H 2 O 2 (2 мМ), показали высокий процент клеток апоптоза (53,62%). Таким образом, эти данные позволяют предположить, что rhLf использует путь апоптоза для проявления своей цитотоксичности, о чем свидетельствует экстернализация PS.
rhLf вызывает значительную экстернализацию фосфатидилсерина на клетках MDA-MB-231 после 24 часов инкубации. Механизм rhLf, вызывающий гибель клеток, апоптоз или некроз, исследовали после двойного окрашивания клеток аннексином V-FITC и PI и контролировали с помощью проточной цитометрии. Общий процент популяций апоптотических клеток ( ось y ) выражается как сумма как ранних, так и поздних стадий апоптоза (зеленые столбцы), тогда как клетки, окрашенные только PI, считались популяцией некротических клеток (также по оси y). ; черные полосы; а ). Каждая полоса представляет собой среднее значение четырех независимых измерений, а полоса ошибок — соответствующее стандартное отклонение ( a ). Репрезентативные двухпараметрические точечные диаграммы проточной цитометрии, используемые для определения процентного содержания апоптотических и некротических субпопуляций ( b – e ). Были включены следующие контроли: клетки, обработанные 5% об./об. H 2 O в качестве контроля растворителя ( а, с ); необработанные клетки в качестве отрицательного контроля ( а, г ); и клетки, подвергнутые воздействию 2 мМ H 2 O 2 в качестве положительного контроля цитотоксичности ( a, e ); анализ с использованием двустороннего парного t - критерия Стьюдента включен в качестве значений P ( a ). На каждый образец было получено примерно 10 000 событий (клеток). Для сбора данных и анализа использовалось программное обеспечение для проточной цитометрии Kaluza (Beckman Coulter).
rhLf индуцирует фрагментацию ДНК и изменяет клеточный цикл клеток MDA-MB-231.
Чтобы получить представление о потенциальных механизмах, используемых rhLf для ингибирования пролиферации клеток и/или индукции цитотоксичности, был проведен анализ профиля клеточного цикла. В рамках этой инициативы клетки MDA-MB-231 обрабатывали rhLf CC 10 (6,76 мкг/мл) и CC 20 (9,48 мкг/мл) в течение 72 часов с последующей их пермеабилизацией и окрашиванием для анализа с помощью проточной цитометрии [ 26 , 35 , 41 ]. Здесь анализ клеточного цикла был сосредоточен на различиях в содержании клеточной ДНК на основе раствора ядерной среды выделения (NIM)-4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (NIM-DAPI; Beckman Coulter) и регистрации их флуоресценции. интенсивность сигнала через проточный цитометр Gallios [ 26 , 35 , 41 ]. Величина сигнала флуоресценции эмиссии DAPI прямо пропорциональна содержанию клеточной ДНК. Результаты показали, что процент субпопуляции суб-G0/G1 из клеток, обработанных 6,76 мкг/мл rhLf, был аналогичен проценту субпопуляции субпопуляции G0/G1 из клеток, обработанных 6,76 мкг/мл rhLf, был аналогичен проценту субпопуляции субпопуляции (H 2 O) и необработанных контрольных клеток (,,,). Напротив, клетки, подвергшиеся воздействию 9,48 мкг/мл rhLf, демонстрировали более высокий процент субпопуляции суб-G0/G1 (6%) и считались значимыми по сравнению с растворителем и необработанными контрольными клетками со значениями P 0,00033 и 0,00016 соответственно . (,,,). Эта субпопуляция суб-G0/G1 (гиподиплоидная) является индикатором индуцированной апоптозом фрагментации ДНК [ 34 , 41 ]. Кроме того, эти результаты подтверждают предположение, сделанное во время анализа морфологических изменений с помощью экспериментов по конфокальной микроскопии (выше), указывающее на то, что флуоресцентный сигнал внутри пузырей, вероятно, был обусловлен наличием небольших комплексов фрагментов ДНК-PI. Процентное соотношение в фазе G0/G1 (диплоид; 2N), полученное из клеток, обработанных рчЛф в концентрации 9,48 мкг/мл (45,98%), было значительно снижено ( P <0,01) по сравнению с клетками, обработанными H 2 O (56,97%) и необработанными ( 56,39%) клеток (,,,). Были обнаружены значительные различия в субпопуляциях S-фазы (гипердиплоидных) клеток, обработанных рчЛф с концентрацией 9,48 мкг/мл, по сравнению с клетками, подвергнутыми воздействию 6,76 мкг/мл рчЛф (P = <0,0004), а также с клетками контроля, обработанными растворителем и необработанными . соответственно ( Р < 0,01;,,,). Примечательно, что это увеличение паттерна субпопуляции S-фазы, спровоцированное rhLf, напоминало профиль ареста, индуцированный ингибитором синтеза полипептида G418 (,,). Клетки, подвергшиеся воздействию rhLf с содержанием ДНК G2/M (тетраплоид; 4N), показали такие же процентные значения, как и контрольные растворители и необработанные, и, следовательно, были получены незначительные различия (,,). Результаты, основанные на этой стратегии анализа, позволяют предположить, что рчЛф способен провоцировать индуцированную апоптозом фрагментацию ДНК, а также останавливать клетки в S-фазе, изменяя нормальное течение клеточного цикла. Более того, оба события произошли в выраженной дозозависимой модальности.
rhLf вызывал индуцированную апоптозом фрагментацию ДНК и изменение профиля распределения клеточного цикла на клетках MDA-MB-231 после 72 часов инкубации. Клетки собирали и в один этап фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали DAPI с последующим исследованием с помощью проточного цитометра. a – d Количественная оценка процентной частоты событий/клеток включена вместе с осью y, тогда как различные методы лечения отложены вдоль горизонтальной оси x . Контроли для этой серии экспериментов включали: в качестве контроля растворителя - 5% об./об. H 2 O; в качестве положительного контроля нарушения клеточного цикла — 1 мг/мл G418; и необработанные клетки. Каждый столбик представляет собой среднее значение четырех повторов, а столбцы ошибок обозначают соответствующее стандартное отклонение. Разница значимости (критерий Стьюдента ) между rhLf CC 20 (9,48 мкг/мл) и клетками, обработанными H 2 O (*) или необработанными (‡), соответствовала P <0,01 соответственно. e – h Репрезентативные однопараметрические гистограммы, включая четыре ворота, которые охватывают процент каждой субпопуляции клеток на фазу клеточного цикла. Ворота слева направо: суб-G0/G1, считается апоптотической фрагментацией ДНК; G0/G1, S и G2/M. e – h Количество событий (клеток) отложено вдоль оси y, тогда как содержание ДНК — вдоль оси x. Для сбора и анализа проб использовалось программное обеспечение проточной цитометрии Kaluza (Beckman Coulter).
Обсуждение
Рак молочной железы является наиболее частым злокачественным новообразованием, диагностируемым у женщин во всем мире. Таким образом, в этом исследовании rhLf был протестирован на его способность убивать группу из шести клеточных линий рака молочной железы человека in vitro. Кроме того, частично исследован механизм, используемый rhLf. Более того, включив линию нераковых эпителиальных клеток человека молочной железы и женщин, стало возможным исследовать, обладает ли рчЛФ селективной цитотоксичностью (SCI) в отношении клеток рака молочной железы. Результаты показали, что рчЛф эффективно убивает как неметастатические, так и метастатические клетки с одинаковыми значениями CC 50 (109,46 и 91,4 мкг/мл соответственно) с гораздо менее заметной токсичностью в отношении нераковых клеток MCF-10A (CC 50 1279,48 мкг/мл). ); разница более чем в 11 раз (SCI). Кроме того, rhLf также оказывал цитотоксичность в отношении четырех дополнительных клеточных линий рака молочной железы человека: MDA-MB-468, HCC70, MCF-7 и T-47D, причем значения CC 50 (382,2–823,6 мкг/мл) выше, чем у MDA . -клетки МБ-231. Таким образом, шесть линий клеток рака молочной железы, рассмотренных в этом исследовании, демонстрирующих разные гормональные рецепторы, включая три тройно-негативные клеточные линии (MDA-MB-231, MDA-MB-468 и HCC70), подверглись по-разному воздействию после воздействия rhLf. Эти данные позволяют предположить, что цитотоксический профиль, оказываемый rhLf на клетки рака молочной железы, может быть гормононезависимым рецептором рака молочной железы.
Основная причина, по которой раковые клетки так сложно лечить, связана с их высокой скоростью пролиферации. Крайне желательно найти новые экспериментальные соединения, которые специфически убивают раковые клетки, практически не оказывая воздействия на нормальные клетки. Поэтому важно сравнить цитотоксичность нового экспериментального препарата или соединения на раковых и нераковых («нормальных») клеточных линиях, чтобы оценить его селективную цитотоксичность путем расчета его SCI. Когда значение SCI экспериментального соединения превышает 1, считается, что соединение обладает селективной цитотоксичностью в отношении раковых клеток [ 26 ]. Благоприятный SCI означает, что экспериментальное соединение эффективно убивает раковые клетки, вызывая при этом минимальную токсичность или отсутствие токсичности для нормальных (нераковых) клеток, что является предпочтительной характеристикой для подтверждения эффективности потенциального противоракового препарата [26 , 41 ] . В предыдущей работе Янга и др. [ 10 ] показали, что бычий лактоферрин (bLf) обладал избирательной цитотоксичностью в отношении клеток рака молочной железы по сравнению с клетками MCF-10A, однако значение SCI не учитывалось. Кроме того, Перейра и др. [ 42 ] утверждали, что bLf обладает избирательной цитотоксичностью посредством апоптоза на клетках рака молочной железы, однако значение SCI также не определялось. В этом исследовании рчЛф проявлял избирательную цитотоксичность в отношении неметастатических и метастатических клеток MDA-MB-231 (11,68 и 13,99 соответственно). Кроме того, значения SCI, отображаемые rhLf на четырех дополнительных клеточных линиях рака молочной железы человека: MDA-MB-468, HCC70, MCF-7 и T-47D, были подходящими (1,55–3,34). Таким образом, рчЛф является привлекательным препаратом против рака молочной железы.
Апоптоз — многогранный процесс, включающий несколько морфологических изменений, таких как вздутие плазматической мембраны, сокращение клеток и конденсация ядер. С помощью флуоресцентного окрашивания (Hoechst и PI; анализ DNS) и конфокальной микроскопии были визуализированы потенциальные морфологические изменения, индуцированные rhLf на клетках MDA-MB-231. Предыдущее исследование показало, что bLf не способен провоцировать морфологические изменения, связанные с апоптозом, в клетках MDA-MB-231 [ 43 ]. И наоборот, результаты этого исследования показали, что рчЛф способен вызывать морфологические изменения, связанные с апоптозом в клетках MDA-MB-231, такие как сморщивание клеток, вздутие плазматической мембраны и конденсация ядер.). Кроме того, во время этого анализа внутри пузырей наблюдался сигнал флуоресценции, вероятно, из-за присутствия фрагментов ДНК, образующих комплексы с PI и Hoechst, поскольку оба являются красителями-интеркалаторами ДНК.
Эти наблюдения побудили нас исследовать потенциальное участие цитоскелета в этих клеточных морфологических изменениях. Пузырь плазматической мембраны представляет собой развитие пузырькообразного выпячивания клеточной поверхности, возникающего в результате потери контакта между белками цитоскелета и плазматической мембраной во время апоптоза [ 44 ]. Чтобы проверить, связана ли цитотоксичность, спровоцированная rhLf, с дезорганизацией цитоскелета на клетках MDA-MB-231 и Hs27, были проведены анализы флуоресцентной конфокальной микроскопии. Клетки, подвергшиеся воздействию rhLf, были помечены для обнаружения двух основных полимеризованных белков, образующих цитоскелет, F-актина и тубулина, микрофиламентов и микротрубочек соответственно. Эти анализы показали, что rhLf вызывает разобщение нормальной организации цитоскелета, нарушая сеть микрофиламентов F-актина, что сопровождается образованием нерегулярного пунктирного цитоплазматического рисунка (агресом) как в клетках MDA-MB-231, так и в клетках Hs27. Интересно, что аналогичный эффект возмущения F-актина был индуцирован bLf на клетках T-47D молочной железы [ 42 ].
В условиях гомеостаза распределение фосфолипидов в плазматической мембране эукариотических клеток асимметрично. Это асимметричное распределение фосфолипидов имеет важные функции in vivo [ 45 ]. В норме фосфатидилсерин (ФС) преимущественно ограничен цитоплазматическим листком плазматической мембраны, и нарушение этой асимметрии, приводящее к экстернализации ФС на поверхность клетки, играет центральную роль в качестве сигнала распознавания для активации фагоцитов и продвижения крови. коагуляционный каскад; и является хорошо известным биохимическим признаком апоптоза [ 46 ]. Это событие легко обнаружить с помощью белка аннексина V (~36 кДа), который обладает высоким сродством к ФС. Более того, при использовании метода двойного аннексина V-FITC и окрашивания PI и проточной цитометрии можно определить, использует ли цитотоксичное экспериментальное соединение путь апоптоза или некроза, чтобы вызвать гибель клеток. Предыдущие исследования показали, что при использовании линий клеток bLf и рака молочной железы не было обнаружено апоптотических клеток с экстернализованным PS после 72-часового периода лечения [ 43 ]. В другом исследовании была обнаружена экстернализация PS, индуцированная bLf, в клеточных линиях рака молочной железы Hs 578T и MDA-MB-231 после 48 часов лечения [42 ] . Совсем недавно сообщалось, что bLf активирует апоптоз посредством экстернализации PS в клетках рака предстательной железы PC-3 и остеосаркомы MG-63 после 48 и 72 часов инкубации соответственно [47 ] . В нашем исследовании rhLf вызывал значительную экстернализацию PS (P = 0,004) на тройных негативных клетках MDA-MB-231 после 24 часов воздействия. Этот результат позволяет предположить, что рчЛф, экспрессируемый в P. пасторис, способен индуцировать апоптоз.
Затем мы попытались проанализировать профиль клеточного цикла, чтобы более подробно выяснить механизм, который rhLf использует для оказания своего цитотоксического эффекта. Поздним биохимическим событием в клетках, подвергающихся апоптозу, является фрагментация их ДНК, которая в основном провоцируется эндогенной дезоксирибонуклеазой, активируемой каспазой-3 (CAD), во время фазы выполнения апоптоза [48 ] . В этом биохимическом событии ИБС вызывает деградацию хроматина, генерируя небольшие фрагменты ДНК, которые диффундируют из ядра, образуя субпопуляцию клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, которое легко обнаружить с помощью проточной цитометрии во время анализа клеточного цикла. Эта субпопуляция суб-G0/G1 (гиподиплоидная) появляется в левой части гистограмм проточной цитометрии с одним параметром (DAPI; детектор FL-9) и интерпретируется как клетки, подвергающиеся индуцированной апоптозом фрагментации ДНК [34 , 49 ] . В предыдущем отчете указывалось, что бычий Lf вызывал остановку клеточного цикла в нескольких линиях клеток рака молочной железы, однако для клеток MDA-MB-231 эта остановка происходила в фазе G2 [43 ] . В этом исследовании не было обнаружено фракции клеток в фазе суб-G0/G1. Кроме того, в клетках рака головы и шеи rhLf арестовывал клеточный цикл в контрольной точке G0/G1 [ 50 ]. Более того, rhLf вызывал остановку роста при переходе G1 к S на клетках молочной железы MDA-MB-231 [ 51 ]. Здесь мы подтвердили, что rhLf действительно вызывает остановку клеточного цикла в S-фазе в клетках MDA-MB-231, что напоминает картину, демонстрируемую ингибитором синтеза полипептидов G418, включенным в качестве контроля в эту серию экспериментов. Кроме того, в наших руках rhLf также был способен вызывать фрагментацию ДНК, о чем свидетельствует увеличение субпопуляции суб-G0/G1, что подтверждает приведенные выше морфологические наблюдения, когда сигнал флуоресценции был обнаружен внутри пузырей плазматической мембраны. Таким образом, наши результаты показывают, что рчЛф изменяет клеточный цикл и индуцирует фрагментацию ДНК.
В заключение, наши результаты показывают, что rhLf, экспрессируемый в P. Pastoris , вызывает эффективную токсичность в отношении высокозлокачественных и агрессивных неметастатических и метастатических тройных негативных клеток человека MDA-MB-231 с благоприятными значениями SCI по сравнению с нераковыми эпителиальными клетками человека. Клетки MCF-10A. Кроме того, наш рчЛф выявил морфологические и биохимические характеристики апоптоза на клетках MDA-MB-231. Эти морфологические изменения включали в себя образование пузырьков на плазматической мембране, вероятно, связанное с исчезновением структур формы F-актина, сокращение клеток и конденсацию ядер/хромосом, которые представляют собой все три морфологических изменения, связанных с апоптозом. Кроме того, биохимические изменения, вызванные рчЛф в клетках MDA-MB-231, включали экстернализацию ФС, индуцированную апоптозом фрагментацию ДНК и остановку прогрессирования клеточного цикла; все признаки апоптоза. Наши данные показывают, что рчЛф может быть полезен для эффективного контроля пролиферации клеток рака молочной железы человека с минимальным повреждением нормальных клеток. Кроме того, активность rhLf в отношении рака молочной железы заслуживает тестирования на модели животных.
Благодарности
BFIF благодарит Национальный совет науки и технологий (CONACyT) за докторскую степень. грант на обучение. Финансирование этой работы было поддержано внутренним грантом (2016–2017 гг.) Факультета де Ciencias Químicas, Автономного университета Чиуауа QRC, а также частично предоставлено Национальным институтом общих медицинских наук - Поддержка конкурентных исследований (SCORE ) предоставить RJA 1SC3GM103713. Авторы выражают благодарность центрам цитометрии, скрининга и визуализации, анализа биомолекул и геномного анализа Техасского университета в Эль-Пасо (UTEP). Эти основные учреждения были поддержаны грантом 5G12MD007592 программы «Исследовательские центры в учреждениях меньшинств» (RCMI) Пограничному центру биомедицинских исследований (BBRC) в UTEP от Национального института здоровья меньшинств и различий в здоровье, входящего в состав Национальных институтов здравоохранения. Авторы также благодарят Глэдис Альмодовар и Лизетт Контрерас (обе из UTEP) за выдающиеся технические знания и знания в области клеточных культур, а также профессора Джулио Франсиа (из UTEP) за щедрый дар клеточной линии MDA-MB-231/LM2–4.
Сноски
Соблюдение этических норм
Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Рекомендации
2.
Ван дер Страте Б., Хармсен М., Шефер П., Сварт П., Ян Г., Шпеер С., Мейер Д., Хампрехт К. (2001). Вирусная нагрузка в грудном молоке коррелирует с передачей цитомегаловируса человека недоношенным новорожденным, но концентрации лактоферрина не коррелируют с передачей цитомегаловируса человека недоношенным новорожденным. . Clin Diagn Lab Immunol 8 : 818–821 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]3. Иглесиас-
Фигероа Б.Ф., Эспиноза-Санчес Э.А., Сикейрос-Сендон Т.С., Раскон-Крус К. (2018) Лактоферрин как нутрицевтический белок из молока, обзор , Int Dairy J. 10.1016/j.idairyj.2018.09.004 [ CrossRef ] [ Академия Google ]4.
Гарсия-Монтойя И.А., Сендон Т.С., Аревало-Гальегос С., Раскон-Крус К. (2012) Лактоферрин — множественный биоактивный белок: обзор . Biochim Biophys Acta (BBA)-Gen Subj 1820 : 226–236 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]5.
Сикейрос-Сендон Т., Аревало-Гальегос С., Иглесиас-Фигероа Б.Ф., Гарсиа-Монтойя И.А., Саласар-Мартинес Х., Раскон-Крус К. (2014)Иммуномодулирующие эффекты лактоферрина . Acta Pharmacol Sin 35 : 557–566 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Академия Google ]6.
Джансанти Ф., Панелла Г., Лебофф Л., Антонини Дж. (2016) Лактоферрин из молока: нутрицевтические и фармакологические свойства . Фармацевтика 9:61 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]9.
Абу-Сери М.М., Эль-Фахарани Э.М. (2017) Эффективность новых нанокомбинаций белков бычьего молока (лактопероксидазы и лактоферрина) для борьбы с различными линиями раковых клеток человека . Научный отчет 7 : 16769. [ Бесплатная статья о PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]10.
Чжан Й., Лима К.Ф., Родригес Л.Р. (2014) Противораковые эффекты лактоферрина: основные механизмы и будущие тенденции в терапии рака . Nutr Rev 72 : 763–773 [ PubMed ] [ Google Scholar ]11.
Ян Н., Рекдал О., Стенсен В., Свендсен Дж. (2002) Повышенная противоопухолевая активность и селективность пептидов, полученных из лактоферрина . J Pept Res 60 : 187–197 [ PubMed ] [ Google Scholar ]12.
де Мехия Э.Г., Диа В.П. (2010) Роль нутрицевтических белков и пептидов в апоптозе, ангиогенезе и метастазировании раковых клеток . Раковые метастазы. Ред. 29 : 511–528 [ PubMed ] [ Google Scholar ]13.
Роза Л., Кутон А., Лепанто М.С., Паэсано Р., Валенти П. (2017). Лактоферрин: природный гликопротеин, участвующий в гомеостазе железа и воспалении . Int J Mol Sci 18 :1985 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]14.
Казан Х.Х., Урфали-Маматоглу С., Гундуз У (2017). Метаболизм железа и лекарственная устойчивость при раке . Биометаллы 30 : 629–641 [ PubMed ] [ Google Scholar ]15.
Лежандр С., Гарсион Э. (2015) Метаболизм железа: палка о двух концах в резистентности глиобластомы к терапии . Trends Endocrinol Metab 26 : 322–331 [ PubMed ] [ Google Scholar ]16.
Диксон С.Дж., Лемберг К.М., Лампрехт М.Р., Скута Р., Зайцев Е.М., Глисон К.Э., Патель Д.Н., Бауэр А.Дж., Кэнтли А.М., Ян В.С. (2012)Ферроптоз: железозависимая форма неапоптотической гибели клеток . Ячейка 149 : 1060–1072 [ бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]17.
Ян В.С., ШриРамаратнам Р., Уэлш М.Э., Шимада К., Скута Р., Вишванатан В.С., Чеа Дж.Х., Клемонс П.А., Шамджи А.Ф., Клиш CB (2014)Регуляция ферроптотической гибели раковых клеток с помощью GPX4 . Ячейка 156 : 317–331 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Академия Google ]18.
Иглесиас-Фигероа Б., Вальдивьесо-Година Н., Сикейрос-Сендон Т., Синагава-Гарсия С., Аревало-Гальегос С., Раскон-Крус К. (2016)Высокоуровневая экспрессия рекомбинантного бычьего лактоферрина в Pichia Pastoris с противомикробной активностью . Int J Mol Sci 17 :902 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]20.
Муньос Р., Ман С., Шакед Ю., Ли С.Р., Вонг Дж., Франсия Дж., Кербел Р.С. (2006) Высокоэффективное нетоксичное доклиническое лечение распространенного метастатического рака молочной железы с использованием комбинированной пероральной метрономной химиотерапии с UFT-циклофосфамидом . Рак Рез . 66 : 3386–3391 [ PubMed ] [ Академия Google ]21.
Кайо Р., Олив М., Крусигер К.В. (1978) Длительные клеточные линии рака молочной железы человека метастатического происхождения: предварительная характеристика . In vitro 14 : 911–915 [ PubMed ] [ Google Scholar ]22.
Ли А.В., Остеррайх С., Дэвидсон Н.Е. (2015) Клетки MCF-7 — меняющие ход исследований и лечения рака молочной железы на 45 лет . JNCI: J Natl Cancer Inst . 10.1093/jnci/djv073 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Академия Google ]23.
Газдар А.Ф., Курвари В., Вирмани А., Голлахон Л., Сакагучи М., Вестерфилд М., Кодагода Д., Стасны В., Каннингем Х.Т., Вистуба II (1998). Характеристика парных опухолевых и неопухолевых клеточных линий, полученных от пациентов с раком молочной железы. . Int J Cancer 78 : 766–774 [ PubMed ] [ Google Scholar ]24.
Кейдар И., Чен Л., Карби С., Вайс Ф., Деларея Дж., Раду М., Чайчик С., Бреннер Х. (1979). Установление и характеристика клеточной линии происхождения карциномы молочной железы человека . Eur J Cancer (1965) 15 : 659–670 [ PubMed ] [ Google Scholar ]25.
Соул Х.Д., Мэлони Т.М., Вулман С.Р., Петерсон В.Д., Бренц Р., МакГрат К.М., Руссо Дж., Поли Р.Дж., Джонс Р.Ф., Брукс С. (1990). Выделение и характеристика спонтанно иммортализованной линии эпителиальных клеток молочной железы человека, MCF-10 . . Cancer Res 50 : 6075–6086 [ PubMed ] [ Google Scholar ]26.
Роблес-Эскахеда Э., Дас У., Ортега Н.М., Парра К., Франсия Дж., Диммок Дж.Р., Варела-Рамирес А., Агилера Р.Дж. (2016). Новый куркуминоподобный диенон индуцирует апоптоз в клетках тройного негативного рака молочной железы . Cellular Oncol 39 : 265–277 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Академия Google ]27.
Нуньес Л.М., Роблес-Эскахеда Э., Сантьяго-Васкес И., Ортега Н.М., Лема С., Муро А., Альмодовар Г., Дас У, Дас С., Диммок Дж.Р. (2014). Пол клеточных линий имеет значение при скрининге на новые анти- лекарства от рака . AAPS J 16 : 872–874 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Академия Google ]28.
Лема С., Варела-Рамирес А., Агилера Р.Дж. (2011) Анализ дифференциального ядерного окрашивания для высокопроизводительного скрининга для выявления цитотоксических соединений . Карр Селл Биохим 1 :1. [ Бесплатная статья о PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]29.
Варела-Рамирес А., Костанцо М., Карраско Ю.П., Паннелл К.Х., Агилера Р.Дж. (2011). Цитотоксические эффекты двух оловоорганических соединений и их способ вызвать гибель клеток четырех раковых клеток млекопитающих . Cell Biol Toxicol 27 : 159–168 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]30.
Сантьяго-Васкес Ю, Дас У, Варела-Рамирес А, Бака С.Т., Аяла-Марин Ю, Лема С, Дас С, Бариян А, Диммок Дж.Р., Агилера Р.Дж. (2016) Опухолеселективная цитотоксичность нового аналога пентадиена на клетки лейкемии/лимфомы человека . Clin Cancer Drugs 3 : 138–146 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]31.
Гутьеррес Д.А., ДеХесус Р.Э., Контрерас Л., Родригес-Паломарес И.А., Вильянуэва П.Дж., Бальдеррама К.С., Монтерроса Л., Ларрагойти М., Варела-Рамирес А., Агилера Р.Дж. (2019). Новый пиридазинон проявляет сильную цитотоксичность в отношении раковых клеток человека посредством апоптоза . и накопление полиубиквитинированного белка , Cell Biol Toxicol . 10.1007/s10565-019-09466-8 [ бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]32.
Сьерра-Фонсека Х.А., Наджера О., Мартинес-Хурадо Дж., Уокер Э.М., Варела-Рамирес А., Хан А.М., Миранда М., Ламанго Н.С., Ройчоудхури С. (2014). Фактор роста нервов индуцирует рост нейритов клеток PC12, стимулируя Взаимодействие Gβγ-микротрубочек . BMC Neurosci 15 :132. [ Бесплатная статья о PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]33.
Контрерас Л., Кальдерон Р.И., Варела-Рамирес А., Чжан Х.И., Куан Ю., Дас У., Диммок Дж.Р., Скута Р., Агилера Р.Дж. (2018). Индукция апоптоза посредством ингибирования протеасом в клетках лейкемии/лимфомы двумя мощными пиперидонами , Клетка Онкол . 10.1007/s13402-018-0397-1 [ бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]34.
Роблес-Эскахеда Э., Лерма Д., Ньякерига А.М., Росс Дж.А., Киркен Р.А., Агилера Р.Дж., Варела-Рамирес А. (2013). В поисках противораковой активности в матери-природе: антипролиферативный и проапоптотический эффект, вызываемый зеленым цветом. ячмень на клетках лейкемии/лимфомы . PLoS ONE 8 :e73508. [ Бесплатная статья о PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]37.
Клейтон Дж.А., Коллинз Ф.С. (2014). Политика: Национальный институт здравоохранения стремится сбалансировать пол в исследованиях на клетках и животных . Nat News 509 :282 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]38.
Гарсиа-Мата Р., Бебёк З., Соршер Э.Дж., Штул Э.С. (1999) Характеристика и динамика образования агресом цитозольной Gfp-химерой . J Cell Biol 146 : 1239–1254 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]39.
Ласаро-Дьегес Ф., Агуадо С., Мато Е., Санчес-Руис Ю., Эстебан И., Альберч Дж., Кнехт Э., Эгеа Г. (2008)Динамика F-актиновой агресомы, генерируемой стабилизирующим актин токсином джасплакинолидом . J Cell Sci 121 : 1415–1425 [ PubMed ] [ Google Scholar ]40.
Левентис П.А., Гринштейн С. (2010) Распределение и функция фосфатидилсерина в клеточных мембранах . Ann Rev Biophys 39 : 407–427 [ PubMed ] [ Google Scholar ]41.
Вильянуэва П.Дж., Мартинес А., Бака С.Т., ДеДжесус Р.Э., Ларрагоити М., Контрерас Л., Гутьеррес Д.А., Варела-Рамирес А., Агилера Р.Дж. (2018). Пиронаридин оказывает мощную цитотоксичность на клетки молочной железы и гематологические раковые клетки человека посредством индукции апоптоза , PLoS . ОДИН 13 : e0206467. [ Бесплатная статья о PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]42.
Перейра CS, Guedes JP, Gonçalves M, Loureiro L, Castro L, Geros H, Rodrigues LR, Côrte-Real M (2016). Лактоферрин избирательно запускает апоптоз в клетках рака молочной железы с высокой степенью метастаза за счет ингибирования плазмалеммальной V-H+-АТФазы . Онкоцель 7 :62144. [ Бесплатная статья о PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]43.
Чжан Й., Лима К.Ф., Родригес Л.Р. (2014). Бычий лактоферрин индуцирует остановку клеточного цикла и ингибирует передачу сигналов mTOR в клетках рака молочной железы . Nutr Cancer 66 : 1371–1385 [ PubMed ] [ Google Scholar ]44.
Коулман М.Л., Сахай Э.А., Йео М., Бош М., Дьюар А., Олсон М.Ф. (2001). Мембранные пузыри во время апоптоза возникают в результате опосредованной каспазой активации ROCK I. Nat Cell Biol 3 :339. [ PubMed ] [ Академия Google ]45.
Фадил Б., Сюэ Д. (2009) Все тонкости фосфолипидной асимметрии в плазматической мембране: роль в здоровье и болезни . Crit Rev Biochem Mol Biol 44 : 264–277 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]46.
Сэвилл Дж., Дрансфилд И., Грегори С., Хаслетт С. (2002) Взрыв из прошлого: очистка апоптотических клеток регулирует иммунные реакции . Нат Рев Иммунол 2 :965. [ PubMed ] [ Академия Google ]47.
Guedes JP, Pereira CS, Rodrigues LR, Côrte-Real M (2018). Лактоферрин бычьего молока избирательно убивает метастатические клетки рака предстательной железы PC-3 и остеосаркомы MG-63 in vitro . Передний Онкол . 10.3389/fonc.2018.00200 [ бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]48.
Сакахира Х., Энари М., Нагата С. (1998) Расщепление ингибитора CAD при активации CAD и деградации ДНК во время апоптоза . Природа 391 :96. [ PubMed ] [ Академия Google ]49.
Долбир Ф., Грацнер Х., Паллавичини М., Грей Дж. (1983). Измерение методом проточной цитометрии общего содержания ДНК и включенного бромдезоксиуридина . Proc Natl Acad Sci 80 : 5573–5577 [ Бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]50.
Сяо Ю., Монитто К.Л., Минхас К.М., Сидрански Д. (2004). Лактоферрин подавляет активность циклин-зависимых киназ G1 во время остановки роста раковых клеток головы и шеи . Clin Cancer Res 10 : 8683–8686 [ PubMed ] [ Google Scholar ]51.
Дэмиенс Э., Эль Язиди И., Мазурье Дж., Дютилле И., Спик Г., Бойли-Марер И. (1999). Лактоферрин ингибирует циклин-зависимые киназы G1 во время остановки роста клеток карциномы молочной железы человека . J Cell Biochem 74 : 486–498 [ PubMed ] [ Google Scholar ]
1.jpg)
